质粒电泳,质粒DNA电泳三条带

2022年01月20日10:42:55质粒电泳,质粒DNA电泳三条带已关闭评论11

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质粒 DNA 电泳的三条带 质粒是细胞内的一种环状的小分子 DNA,是进行 DNA 重组的常用载体.作为一个具有 自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外, 质粒 DNA 上携带了部分的基因信息, 经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状.在 DNA 重组中,质粒或经过改造后的质粒 载体可通过连接外源基因构成重组体. 从宿主细胞中提取质粒 DNA,是 DNA 重组技术中最基础的实验技能.分离质粒 DNA 有三 个步骤: 1,培养细菌使质粒扩增 2,收集和裂解细菌 3,分离和纯化质粒 DNA 碱裂解法是较常用的提取的方法.其优点是得率高,适合于大多数的和菌株,所得产物 经纯化后可满足多数的 DNA 重组操作. 此法采取酸碱度高达 Ph12.6 的碱溶液使 DNA 发生 变性.由于质粒和主染色体的拓扑结构不同,变性时前者虽然两条链分离,但仍然缠绕在一 起不分开;而后者完全变性分,甚至出现断裂.因此,当加入中和液时,溶液 Ph 值恢复较 低的近中性水平,此时, 质粒的两条小分子单链可迅速复性,恢复双链结构,但是主染色 体 DNA 则无法复性.在离心时,大部分主染色体与细胞碎片,杂质等缠绕一起被沉淀,而 可溶性的质粒 DNA 留在上清夜中. 在质粒提取过程中,由于机械力,酸碱度,试剂等的原因,可能使质粒 DNA 链发生断裂. 所以,多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒: 共价闭合环状 DNA(cccDNA): 质粒的两条链没有断裂;超螺旋 开环 DNA(ocDNA): 质粒的一条链断裂;松弛的环状分子 线形 DNA(lDNA): 质粒的两条链均断裂;线性分子

质粒 DNA 琼脂塘凝胶电泳模式图 质粒 DNA 的分子构型 由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭,因此,在紫 外线照射下 DNA 电泳带成橘黄色. (a)松弛线性的 DNA; (a)道中的 SC DNA 走在最前沿,OC DNA 则位于凝 (b)松弛开环的 OC 构型; (c)超螺旋的 SC 构型 胶的最后边; (b)道中的 L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后 产生的,它在凝胶中的位置介于 OC DNA 和 SC DNA 之间三,材料,试剂及器具 1,材料 E.coliDH 5α(pUC 19 vector) 2,试剂 1)LB 培养基 2)TE 缓冲液 3)裂解液:溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ 4)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)

5)无水乙醇 6)70%乙醇 7)氨苄青霉素 50mg/mL 器具 离心机,离心管,吸嘴 四,操作步骤以 1%比例把 E.coliDH5α(含 PUC18)接种于含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml)的 LB 培养基 中 37℃振摇过夜(12-18h) ↓ 取 1.5ml 培养物置离心管中 ↓ 10000rpm,离心 1min,或 4000rpm,离心 5-10min ↓ 去上清,倒扣干净吸收纸上吸干 ↓ 沉淀+100μL 溶液Ⅰ ↓ 加或不加入少量溶菌酶粉末;混匀,室温放置 10min ↓ +加 200μL 溶液Ⅱ(新鲜配置) ↓ 温和颠倒数次,混匀,冰上放置 5min ↓ +150μl 溶液Ⅲ→颠倒混匀,冰上放置 15min ↓

离心 12000rpm,15min ↓ 上清液+等体积酚:氯仿:异戊醇振匀,12000rpm,离心 5min ↓ 小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质 ↓ 上清液+2 倍体积无水乙醇混匀,室温 5min-10min ↓ 12000rpm,5min-15min ↓弃上清 沉淀+1mL70%乙醇 ↓ 12000rpm 离心 5min-15min ↓ 弃上清;并倒扣离心管使液体流干 ↓+ 自然干燥或真空抽干(看不到液滴为宜) ↓ 加 50μlTE 缓冲液(20μg/mlRNaseA)溶解质粒粗取物 ↓ -20℃保存 六,实验报告 检查,保存提取的质粒,要求记录实验现象并说明原因. 七,思考题 分析以下试剂的作用原理: 溶液Ⅰ:50mmol/L 葡萄糖

5mmol/Ltris HCL (Ph 8.0) 10mmol/L EDTA(PH8.0) 溶液Ⅱ:0.4mol/L NaOH 2% SDS 使用前新鲜配制 溶液Ⅲ:5mol/L Kac 60 mL 冰醋酸 11.5 mL 水 28.5 mL RNase A 酶: 将粉末溶于 10mmol/L tris HCL (Ph7.5), 15mmol/L NACL 中, 配成 10 mg/mL 浓度的酶液,于 100℃水浴加热 15 min,缓慢冷却至室温,-20℃保存 氯仿 无水乙醇

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